Red基因编辑重组

一、技术简介
      Red基因重组技术，能使外源同源线性DNA片段快速与基因组DNA相应基因同源重组，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三个协助质粒。pKD46质粒由exo、beta、gam三个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质，在一定浓度阿拉伯糖诱导下或诱导表达此三种蛋白。通过外源构建同源线性片段，导入受体菌，在这三种蛋白的协助下与受体菌基因发生同源重组，最终实现基因的突变和缺失。同时pKD46质粒是温度敏感型质粒，42°C条件下其会自动丢失。pKD3为克隆氯霉素抗性基因提供模板,与此同时在此质粒中，Cm两侧有FRT位点，该位点能够被FLP重组酶识别，当重组酶存在时会将此位点之，间的片段进行剪接，从而实现了Cm'去除，因此不仅为实验进行引入抗性标记，方便了重组菌的筛选，更重要的是此抗性标记会在因FRT位点的引入在需要时被酶切剔除。pCP20能够表达FLP重组酶，进而识别重组到基因组上的FRT位点，由此酶切掉两位点之间引入的抗性基因片段片段，最终实现目的基因的缺失。pCP20同为温敏型质粒，培养条件高于42°C时自动丢失。
     与Red同源重组基因敲除相关的3个酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
二、实验步骤
1、制备pKD46/宿主菌电转感受态。
2、制备抗性基因打靶片段。
3、电转，筛选阳性克隆。
4、导入PCP20质粒消除抗性，无痕敲除。
三、相关质粒（点击可查看图谱和序列）
pKD46，氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD46-Tet，四环素抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD20，氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pREDKI，卡那抗性，I-SceI,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKDsgRNA-ack 阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶，四环素诱导转录sgRNA
pREDCas9：携带针对氨苄基因的gRNA
pKD13，提供卡那霉素抗性重组模板
pKD4，提供卡那霉素抗性重组模板
pKD3，提供氯霉素抗性重组模板
pCP20：FLP重组酶消除抗性