免疫荧光技术（IFC）

免疫荧光技术（IFC）  

（一），普通免疫荧光（单标）
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。

一般实验过程：

1、切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇  Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。

2、 抗原修复：我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

3、血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

4、加一抗：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的切片上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。

5、加荧光二抗： PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。

注意：此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。

6、复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

7、封片镜检：用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
（二），普通免疫荧光（双标）

1、 切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。

2、 抗原修复：我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

3、 血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

4、 加一抗：甩去封闭液，不洗，然后滴加稀释好的一抗（ ），加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜（15h）。

5、 加荧光二抗： PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光（FITC）标记羊抗小鼠IgG，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。

注意：此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。

6、 血清封闭：用吸水纸擦干玻片，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

7、 加一抗：甩去封闭液，不洗，然后滴加稀释好的一抗，加完一抗后于4°C湿盒中避光孵育过夜。（注意：第二种一抗的种属与第一种一抗的种属要来源不同才可以，如小鼠和兔）

8、加荧光二抗： PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。（注意：若检测第一种抗体选用的是红色荧光，则第二种必须得选择其他颜色的荧光）

9、复染核：滴加 DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

10、用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
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